Dış Kaynaklı Proje Süreçleri Yönetim Sistemi
Son yıllarda, hücre dışı RNA’ların (extracellular RNA, exRNA), özellikle hücre dışı veziküller (extracellular vesicles, EV) aracılığıyla taşındıklarında, hedef hücrelerin genetik programlarını yeniden düzenleme ve fizyolojik süreçlerini etkileme potansiyeline sahip oldukları gösterilmiştir. Patojenik bakteriler tarafından salgılanan EV’ler (pEV), taşıdıkları exRNA’lar aracılığıyla konak hücrelerde bağışıklık yanıtlarını modüle edebilmekte, transkripsiyonel yeniden programlamayı tetikleyebilmekte ve apoptoz gibi hücresel kader yollarını aktive edebilmektedir. Bu bağlamda, mikrobiyal EV’lerin taşıdığı exRNA’ların insan beyin dokularında nöronal bütünlüğü bozabileceği, hayatta kalma mekanizmalarını zayıflatabileceği ve nihayetinde nörodejeneratif süreçlerin başlangıcını tetikleyebileceği hipotezi, bu projenin temel araştırma sorusunu oluşturmaktadır. Önerilen proje kapsamında, patojenik mikrobiyal hücre dışı veziküllerin taşıdığı exRNA’ların, insan kaynaklı serebral organoid modellerinde nörodejeneratif etkiler oluşturup oluşturmadığı çok yönlü olarak araştırılacaktır. Çalışma, yalnızca pEV uygulamasının erken dönem nöronal bütünlük kaybı ve apoptoz üzerindeki etkilerini analiz etmekle kalmayacak; aynı zamanda bu etkilerin transkriptomik ve proteomik düzeydeki yansımalarını inceleyerek, pEV-exRNA kaynaklı düzenleyici ağları sistem biyolojisi yaklaşımıyla ortaya koymayı hedeflemektedir.
Proje kapsamında, literatürde nörodejeneratif süreçlerle ilişkisi gösterilmiş ve tarafımızca da doğrulanmış olan bakteriyel türler (örneğin Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Enterococcus faecalis) ve kontrol grubu olarak patojen olmayan suşlar model mikroorganizmalar olarak kullanılacaktır. Bu mikroorganizmaların pEV ve npEV (non-patojenik EV)’leri, kademeli santrifüjleme ve ultrasantrifüjleme yöntemleriyle izole edilecek; morfolojik özellikleri transmisyon elektron mikroskobu (TEM), boyut dağılımı ve partikül sayısı dinamik ışık saçılımı (DLS) ile değerlendirilecek ve Western Blot (WB) ile tanımlanacaktır. 4 patojen ve 4 patojen olmayan bakteriden oluşacak popülasyonlardan (pEVmix ve npEVmix) elde edilecek EV’lerin içeriğindeki küçük RNA'lar, küçük RNA dizileme (sRNA-seq) analizleriyle tanımlanacak, böylece popülasyonlar için karakteristik veziküler exRNA profili oluşturulacaktır. İkinci aşamada, insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerinden (iPKH) türetilmiş serebral organoidler üretilecek ve NeuN, MAP2, βIII-tubulin, SOX2 ve GFAP belireçleri kullanılarak immünhistokimyasal olarak karakterize edilecektir. Deneysel uygulamalarda, organoidler 10 ve 100 µg/mL dozlarında pEV ve npEV ile 24 ve 72 saat gibi farklı süreler için indüklenecek, nörodejeneratif yanıtlar çok katmanlı analizlerle değerlendirilecektir. Fenotipik düzeyde, pEV’lerin CO’lar üzerindeki etkileri akış sitometrisi (CD133, CD171; Annexin V/PI), Western blot ve immünfloresan mikroskopi ile (Nöronal Yapı: MAP2, βIII-tubulin; Apoptoz: cleaved caspase-3, BCL-2; Oksidatif Stres: HO-1, Nrf2) analiz edilecektir. pEV uygulamasına bağlı fizyolojik değişiklikler, mikroelektrot array (MEA) ile ölçülerek nöral ağ aktivitesindeki bozulmaların elektrofizyolojik karşılıkları ortaya konacaktır. Moleküler düzeyde, pEV uygulaması sonrası CO’larda oluşan transkriptomik değişiklikler mRNA-sekanslama (RNA-seq) ile belirlenerek pEV’lerde tanımlanan exRNA profilleriyle ilişkilendirilecektir. Elde edilen veriler, nanoLC-MS destekli proteomik analizlerle entegre edilerek, pEV/exRNA-mRNA–protein etkileşim haritası oluşturulacaktır. Bu haritadan seçilecek, nörodejeneratif süreçlerle ilişkilendirilebilecek en belirgin gen–protein çifti için özgül siRNA’lar tasarlanacak; pEV uygulaması siRNA varlığında ve yokluğunda tekrar edilerek, hedef genin düzeyi RT-qPCR/WB ile, ilgili proteinlerin (MAP2, βIII-tubulin, cleaved caspase-3, BCL-2, HO-1, Nrf2) düzeyi ise Western blot yöntemiyle doğrulanacaktır. Son aşamada, pEV’lerin nöral metabolizma üzerindeki etkileri, gerçek zamanlı 18O izotop etiketli metabolik akış analizleri (fluxomics) ile değerlendirilecek ve enerji metabolizmasındaki olası değişimler nicel olarak ortaya konacaktır. Böylece, pEV kaynaklı exRNA’ların, nöral yapı, gen ekspresyonu, protein düzeyi ve metabolizma üzerindeki bütüncül etkileri tanımlanacaktır.
Bu proje, mikrobiyal kaynaklı exRNA’ların insan beyni üzerindeki etkilerini inceleyen özgün bir model sunmakta ve pEV-exRNA etkileşiminin nörodejeneratif süreçleri nasıl başlatabileceğine dair ilk işlevsel verileri üretmeyi amaçlamaktadır. Proje çıktılarının, mikrobiyal etkenlerin merkezi sinir sistemi hastalıklarına katkısını anlamaya ve exRNA araştırmalarında insan beyin benzeri modellerin translasyonel kullanımına önemli katkılar sunması beklenmektedir. Literatürde benzer bir çalışmanın bulunmaması, önerilen projeye önemli bir özgünlük kazandırmakta; disiplinlerarası yaklaşımıyla hücre dışı vezikül araştırmaları, organoid biyolojisi, omik teknolojiler ve nöral modelleme alanlarında genç araştırmacılar için değerli bir eğitim platformu oluşturmaktadır.