Dış Kaynaklı Proje Süreçleri Yönetim Sistemi
Bitirim C. , Tuncay E. (Yürütücü), Billur D. , Akat F. , Tokcaer keskin Z.
Metabolik sendrom (MetS) göbek çevresi yağlanma, kan şekeri düzeylerinde düzensizlik, insülin direnci ve yüksek kan basıncı ile karakterize olan ve kalp krizi, inme yanında bireylerde diyabet riskini arttıran metabolik bir bozukluktur. Yapılan çalışmalarda, MetS geliştirilmiş deney hayvanlarında ve MetS’lu bireylerde kalbin elektriksel ve mekanik aktivitelerin önemli derecede bozulduğu gözlenmiştir. Çeşitli incelemeler bu değişimlerin kontraktil proteinlerin fosforilasyon, glikozilasyon, asetilasyon gibi post-translasyonel mekanizmalardaki değişimlerle ilişkili olduğunu göstermektedir. Protein asetilasyonunun miyokard enfarktüsü ve kalp yetmezliği gibi kalp hastalıklarının patogenezinde rol oynadığı da bildirilmektedir. NAD+ bağımlı deasetilazlardan olan sirtüinlerin (SIRT) tip-II diyabet, obezite, kanser, yaşlanma ve çeşitli nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde önemli rol oynadığı düşünülmektedir. Metabolik süreçlerin bozulmasına dayalı gelişen çeşitli komplikasyonlara karşı SIRT1- ve SIRT2-deasetilazların kalpte ve birçok dokuda lizin (K)-asetilasyonu sonucu koruyucu etkilerinin bilinmesine karşın, bu deasetilazların diyabetik kardiyomiyopatide (insülin direnci ile karakterize), değiştiği gösterilmiş olan GLUT4 trafiğinde ve glikoz taşınım metabolizmasındaki rolü ve sirtüinlerin hangi mekanizmalarla kalpte koruyucu etki oluşturabileceği henüz tam olarak bilinmemektedir. Bundan dolayı, bu sirtüinlerin aktivite seviyelerinin bu mekanizmalar arasında bulunan insülin direnci ilişkili GLUT4 trafiğinde ve glikoz taşınım yolağındaki etkilerinin incelenmesi temel amacımızı oluşturmaktadır. Böylece elde edilecek verilerimiz sirtüinlerin insülin direnci gelişmiş bireylerde kalpte koruyucu etkisinin hem mekanizması ve hem de hangi yeni tedavi yaklaşımlarının önemli olacağı klinik uygulamalara yol gösterici olacaktır.
Ön çalışmalarımızda ve daha önceki projelerimizden elde edilen sonuçlarda, insülin direnci gelişmiş sıçanlarda, açlık kan şekerinin ve kandaki insülin miktarının arttığı, kalbin kasılma ve gevşeme kinetiklerinin yavaşladığı ve toplam K-asetilasyonunun 2-kattan daha fazla oranda arttığı gözlenmiştir. Proje önerimizde hem in vivo ve hem de in vitro koşullarda incelemeler planlanmış olup, yüksek karbonhidrat diyeti indüklü insülin direnci gelişmiş sıçanlar (MetS) ve palmitik asit inkübasyonu ile insülin direnci oluşturulmuş H9c2 hücre hatları kullanılacaktır. Projemizin birinci ve ikinci iş paketini kapsayan döneminde insülin direncinin sodyum-glikoz ko-transporter 2 (SGLT2) ve GLUT4 gibi proteinlere ilişkin toplam K-asetilasyonu ile protein K-asetilasyonlarına olan etkisi, K-asetilasyonunun hücre içi serbest Na+-seviyesine ve toplam glikoz taşınımına olan etkisi biyokimyasal ve hücre seviyesinde görüntüleme teknikleri kullanılarak incelenecektir. Ayrıca, kardiyomiyositlerde, K-asetilasyonunun GLUT4 aracılı glikoz taşınımındaki rolü, doğrudan insülin uyarımına bağlı veya bağımsız olarak GLUT4 trafiği üzerindeki etkisi, bir başka glikoz-taşıyıcısı olan SGLT2-trafiğine ve ek olarak SGLT2-aracılı glikoz-taşınımına etkisinin incelenmesi planlanmıştır. Böylece inceleme sonuçlarımız, SIRT1 ve SIRT2 deasetilazlarının SGLT2-GLUT4 ilişkisi üzerinden kalpte koruyucu rolünün olup olmadığı kullanılacak olan biyokimyasal, moleküler, histolojik ve genetik yöntemler ile aydınlatılacaktır. Projemizin 3. iş paketinde, doğrudan GLUT4 K-asetilasyonunun doğrudan glikoz-taşınımına ve trafiğine etkisini incelemek için, site-direkted mutagenez ile GLUT4’ün asetile ve asetile olamayan formlarının H9c2 hücre hatlarında ifadeleri arttırılacaktır. Bunlara ek olarak, glikoz taşınımında GLUT4 dışında trafik proteinlerinin de (EHD ve Rab gibi) katkısının incelenmesi hedeflenmiştir. Bunun için endositoz veya egzositoz yolakları inhibe edilerek, artan K-asetilasyonunun (SIRT1 ve SIRT2 inhibitörleri ile), trafik proteinlerinin K-asetilasyon miktarlarına ve glikoz taşınımına olan etkisi ile bu ilişkide sirtüinlerin rolünün incelenmesi hedeflenmiştir. Projemizin son iş paketini kapsayan bölümde, KATP kanalları ile GLUT4 aracılı glikoz-taşınımı arasında ilişkinin açıklanması hedeflenmiştir. KATP veya GLUT4 ifadesi arttırılmış kardiyomiyositlerde, GLUT4 veya KATP’nin toplam protein seviyesi, hücre zarında bulunma olasılıkları, glikoz-taşınımı, KATP kanal akım ve kinetikleri ile SIRT1 ve SIRT2 deasetilazlarının meydana gelecek değişimlerdeki rolü Western blot, PCR ve patch-clamp yöntemi kullanılarak incelenecektir. Bunun dışında, hücresel iskemi modeli kullanılarak K-asetilasyonunun KATP bağımlı ve bağımsız olarak GLUT4 fonksiyonundaki değişimin iskemi-reperfüzyon sonucu bozulan kalp fonksiyonlarındaki rolü belirlenecektir.
Elde edilecek sonuçlar ile insülin direnci sonucu GLUT4 trafiğinde ve glikoz-taşınım mekanizmasında meydana gelen değişimde K-asetilasyonun rolü ve literatürde eksiklikleri görülen sirtüin-deasetilazlarının bu patolojilerdeki etkileri gösterilecek, böylece sirtüin-deasetilazlarının insülin direnci temelli kalp fonksiyon bozukluğunda kullanılacak klinik uygulamalarda yeni tedavi edici ajanlar olarak kullanılmasına büyük destek sağlanabilecektir.