Dış Kaynaklı Proje Süreçleri Yönetim Sistemi
Cevheroğlu O. (Yürütücü), Parmaksız M. , İmren G.
İnsan genomunun yaklaşık %3’ünü oluşturan 800’ün üzerinde gen tarafından ifade edilen G proteine kenetli reseptörler (GPKR), hücre yüzeyindeki en büyük zara tümleşik protein ailesidir. Hormonlar, nörotransmiterler, iyonlar, ışık ve mekanik uyaranlar gibi çok çeşitli sinyalin algılanması ve hücre içine iletilmesinde görev alırlar. Biyolojik sistemlerdeki kilit rolleri; onkolojik, nörodejeneratif, kardiyovasküler, metabolik ve bulaşıcı hastalıklardaki patofizyolojileri dolayısıyla, reçeteli ilaçların %40’tan fazlası GPKR’leri hedeflemektedir. Bu durum, GPKR’leri hem temel bilim hem de translasyonel araştırmalar açısından merkezi bir konuma yerleştirmektedir.
Bu süper ailenin en büyük ikinci alt ailesini, tek hücreli ökaryotlardan memelilere kadar birçok canlıda korunmuş halde bulunan adhezyon GPKR’ler (aGPKR) oluşturmaktadır. İnsanlarda 33 üyesi tanımlanmış olan aGPKR’ler, fizyolojileri ve moleküler biyokimyaları bağlamında en az karakterize edilmiş reseptör ailesidir. Bu durumun temel nedenlerinden biri, karmaşık mimariye sahip, farklı protein domainlerinden oluşan büyük N-terminal bölgeleridir (NTF). Hücre dışı uyaranları algılamakta da görev alan NTF, otoproteoliz özellikleri ve mekano-duyusal işlevleriyle de öne çıkmaktadır.
Beyin gelişimi, nöronal migrasyon ve hücre polaritesi, merkezi sinir sistemi anjiyogenezi, bağışıklık yanıtı ve üreme gibi süreçlerde görev alan aGPKR’lerin; birçok kanser türü, polikistik böbrek hastalığı, vibratuvar ürtiker, Tip II Usher sendromu, bilateral frontoparietal polimikrogiri ve dikkat eksikliği hiperaktivite bozukluğu gibi patofizyolojilerle ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu geniş fizyolojik ve patofizyolojik yelpaze, aGPKR’leri potansiyel ilaç hedefleri hâline getirmektedir. Ancak bugüne kadar aGPKR’leri özgül olarak hedefleyen terapötik ajanlar bulunmamaktadır.
Birçok GPKR’nin kendileri veya diğer reseptörler ile oligomer kompleksler oluşturduğu bilinmektedir. Bu çoklu yapılar; ligand seçiciliği, sinyal yolakları arasında çapraz iletişim (crosstalk), reseptör trafiği ve hücre yüzeyi mobilitesi gibi monomer reseptörlerin sahip olmadıkları birtakım önemli özellikler sağlamaktadır. Günümüze kadar çok az sayıda aGPKR’nin oligomerik yapılar oluşturabildiği yalnızca nitel (kalitatif) olarak gösterilebilmiştir. İlgili literatürdeki en büyük eksiklik ise; bu komplekslerin nicel oligomerik stokiyometrileri (monomer, dimer, trimer, tetramer oranları) ve bu yapısal organizasyonun reseptör aktivasyonu ya da hastalıkların ilerleyişini nasıl yönlendirdiğinin bilinmemesidir. Özellikle glioblastoma gibi reseptör ekspresyonunun dramatik şekilde arttığı patolojilerde, oligomerleşme dinamiklerinin nasıl etkilendiği önemli bir bilinmeyendir.
Projenin odaklandığı ADGRD1/GPR133, ADGRE2/EMR2 ve ADGRG1/GPR56 reseptörlerinin Glioblastoma’da ekspresyon düzeyleri ciddi şekilde artmaktadır ve bu durum hastalığın prognozu ile doğrudan ilişki göstermektedir. Ayrıca bu üç aGPKR’ler kortikal beyin gelişimi, miyelinasyon, hücre adezyonu ve bağışıklık sistemi düzenlenmesi gibi temel fizyolojik süreçlerde önemli rol oynar. Projenin temel hipotezi; aGPKR oligomerleşmesinin statik bir etkileşim olmadığı, aksine reseptör yoğunluğuna ve hücresel bağlama göre değişerek reseptörün patofizyolojik rolünü belirleyen dinamik bir "moleküler anahtar" olduğudur. Bu hipotezi test etmek amacıyla, projede kalitatif tespitlerin ötesine geçilerek, yüksek hassasiyetli kantitatif ve işlevsel bir metodoloji kurgulanmıştır. Proje kapsamında şu temel amaçlar hedeflenmektedir: (i) ADGRD1, ADGRE2 ve ADGRG1 reseptörlerinin plazma membran trafikleri korunarak floresan/biyolüminesan proteinlerle işaretlenmesi ve Flp-In T-REx hücre hatlarında stabil ifadelerinin sağlanması, (ii) Canlı hücrelerde Biyolüminesans Rezonans Enerji Transferi (nanoBRET) kullanılarak, homo-oligomerik reseptör komplekslerinin spesifikliğinin, rastgele çarpışmaları elimine eden BRET normalizasyonları ve satürasyon analizleri ile kantitatif olarak ortaya konması, (iii) Uzamsal İntensite Dağılım Analizi (SpIDA) ve Süper-Çözünürlüklü haritalama ile, reseptörlerin doğal membran ortamındaki oligomerik popülasyon dağılımlarının (kuantal parlaklık üzerinden hücre zarındaki kesin monomer/dimer/trimer/tetramer oranlarının) haritalanması ve bu dinamik dengenin glioblastomada olduğu gibi, reseptör ekspresyon seviyesindeki değişimlerle nasıl etkilendiğinin incelenmesi, (iv) Fonksiyonel Korelasyon kapsamında, SpIDA'dan elde edilen uzamsal stokiyometri verileri ile nanoBRET etkileşim verilerinin istatistiksel çapraz doğrulamasının (cross-validation) yapılması ve bu nicel bulguların reseptörlerin patofizyolojik işlevleriyle (ör. kanserdeki artan reseptör yoğunluğunun sinyale etkisi) ilişkilendirilmesidir.
Sonuç olarak bu proje; aGPKR oligomerizasyonunu sadece kalitatif olarak teyit etmekle kalmayacak, oligomerleşme derecesinin reseptör fonksiyonuna etkisini hücresel boyutta haritalandıracaktır. Elde edilecek çıktılar, reseptörlerin yapı-işlev mekanizmalarını aydınlatarak, gelecekte çalışmalarda oligomerizasyon arayüzlerinin (örneğin dimer arayüzü, tetramer ara yüzü) tespit edilmesi ve bu yapıları hedef alacak yeni nesil akıllı ilaç tasarımları için güçlü bir farmakolojik temel sunacaktır.